研究淡竹叶清热作用有效部位及化学成分(上)

摘要:目的研究淡竹叶清热作用有效部位及化学成分,为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的制定提供科学依据。方法采用体外抑菌实验筛选淡竹叶有效抑菌部位,并采用HPLC-MS法分析抑菌部位的化学成分。结果淡竹叶甲醇提取部位具有抑菌作用,根据液质联用图谱及文献,分析鉴定出淡竹叶甲醇提取部位中6个化学成分,分别为香草酸、香豆酸、牡荆苷、苜蓿素7-β-D-葡萄糖氧基黄酮、芦竹素或其同分异构体白茅素及苜蓿素。结论淡竹叶甲醇提取部位具有一定的抗菌活性,对各菌种的抑菌效果有较大差异,这一部位可能与淡竹叶清热解毒功效相关。采用HPLC-MS法分析鉴定有效部位化学成分,保留了液相色谱与质谱兼具的微量、快速的优点,结合了前者的高分离效能与后者的准确性及选择性的特点,方法稳定可靠,为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的完善提供科学依据。


关键词: 中药鉴定 淡竹叶 抑菌实验 液质联用


淡竹叶为禾本科植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn. 的干燥茎叶[1]。始载于《本草纲目》,1977年以来的历版《中国药典》均有收载,具有清热除烦、利尿的功效。用于热病烦渴,小便赤涩、淋痛,口舌生疮。淡竹叶为卫生部公布的药食两用中药之一,近年来多有制成保健凉茶[2]、淡竹叶酸奶[3]等。
淡竹叶的有效成分物质基础研究一直较为薄弱,现有化学成分的研究显示淡竹叶主含黄酮、三萜类、多糖、酚性成分、氨基酸、有机酸及多种微量元素等[4～6]。依据现代医学理论,结合淡竹叶的中医临床功效,本实验对淡竹叶不同溶剂的提取部位进行了抑菌活性的研究,对淡竹叶清热有效物质基础进行初步筛选,并运用液质联用分析手段对所筛选的部位进行化学成分分析,为淡竹叶的进一步开发利用和质量标准的制定提供科学依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器手提式压力蒸气灭菌器(上海华线医用核子仪器有限公司);移液枪(北京金花移液器厂);HPLC-MS/MS液质联用仪(Water's公司,型号Quattro Primer,产地:美国)。
1.2 菌株
大肠杆菌 CMCC(B) 44103;金葡菌CMCC(B)26003;乙链菌CMCC(B)32210;绿脓菌CMCC(B)24430。
1.3 药物营养琼脂(国药集团化学试剂有限公司,批号F20040304);肉汤培养基(国药集团化学试剂有限公司,批号20060310);血琼脂基础(国药集团化学试剂有限公司,批号20060228);葡萄糖肉汤(国药集团化学试剂有限公司,批号10010518);香草酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号110776-200402)。牡荆苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号11876-200501)。淡竹叶采于江苏省宝华山,经南京中医药大学鉴定教研室吴启南教授鉴定为禾本科(Gramineae)植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.的干燥茎叶。
2方法与结果
2.1 不同提取部位抑菌实验
2.1.1 提取部位制备
淡竹叶置于多功能提取罐,60%乙醇回流提取5 h,提取液减压回收溶剂得到淡竹叶总浸膏,总浸膏与硅藻土拌匀,分别加入石油醚、二氯甲烷、甲醇、水逐级超声提取,减压回收溶剂,得石油醚提取部位、二氯甲烷提取部位、甲醇提取部位和水提取部位,作为供试品。
2.1.2 不同提取部位抑菌实验取上述供试品各1 g,加入蒸馏水1 ml,超声溶解。在超净工作台上将灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中,待冷却凝固后,用无菌移液管吸取1∶1 000稀释的大肠、金葡、绿脓菌液加到平皿上,用刮铲将菌液涂匀,再用打孔器在培养基上打孔,打孔后每个孔内注入25 μl药液,37℃培养24 h,观察实验结果。结果见表1。表1 淡竹叶不同提取部位抑菌实验结果(略)

从药敏实验中发现,淡竹叶的石油醚、二氯甲烷及水提取部位对该3种细菌抑菌效果为阴性,甲醇提取部位对该3种细菌抑菌效果为阳性,故对甲醇提取部位的抑菌效果做进一步的实验。
2.2 甲醇提取部位抑菌实验
2.2.1 对金葡菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的抑菌实验将甲醇提取部位的浸膏配成相当于生药浓度为40,20,10,5,2.5,1.25,0.625 g·ml-1。同“2.1”项下方法实验,制作培养基,将菌液涂匀于培养基上,打孔,分别注入20 μl的药液,37℃培养,24 h后观察抑菌结果。结果见表2。表2 不同浓度甲醇提取部位对3菌种抑菌圈直径平均值(略)

从表2中我们可以看出淡竹叶甲醇提取部位对金葡菌、绿脓杆菌和大肠杆菌均有一定的抑菌效果,抑菌效果依次为:绿脓杆菌>金葡菌>大肠杆菌,但都属于低敏的范围。
2.2.2 甲醇提取部位对乙链球菌的抑菌实验将提取部位按照浓度为10,5,2.5,1.25,0.625 g·ml-1制作血平板,加入乙链球菌,放入37℃温箱培养24 h,次日观察实验结果。
结果显示,5 g·ml-1以下均有乙链球菌生长,故淡竹叶甲醇提取部位对乙链的抑菌最小浓度为10 g·L-1。
2.3 淡竹叶甲醇提取部位化学成分液质联用分析
2.3.1供试品制备取浙江产淡竹叶20 g,氯仿回流提取脂溶性物质至无色,药渣再用甲醇回流提取至无色,溶液蒸干热水溶解,离心,上清液过大孔树脂,弃去水液与20%乙醇液,收集75%乙醇溶液,减压回收溶剂至干,甲醇定容于5 ml容量瓶中,作为供试品溶液。
2.3.2分析条件色谱条件:色谱柱为 C18(2.1 mm×50 mm,3.5 μm);流动相为A(乙腈),B(水,0.05%甲酸);梯度:0→15 min,A:5%→70%;B:95%→30%;流量0.5 ml·min-1;进样量2μl;柱温40℃;柱后分流后进入质谱仪。
质谱条件:电离源为ESI+;检测方式为正离子模式;毛细管电压为3.0 kV;锥孔电压为30 V;离子源温度为120℃;扫描范围为m/z 150～600;氮气流量为400 L·h-1。
2.3.3 样品分析将供试品溶液分别放入自动进样器中,按选定的测试条件,进行检测,得供试品的总离子流色谱图,结果见图1。

2.3.4 总离子流色谱图中化合物的鉴定根据MS所测定的[M+H]+ 值及质谱图谱,通过检索文献[4～6]及部分标准品对照,鉴定出6个化合物,分别为香