干细胞治疗临床应用与展望(一)

心肌梗死和心力衰竭一直是影响人类健康的主要疾病,在西方发达国家被认为是人类死亡的第一杀手,占死亡原因的第一位。在我国,由于生活水平的提高和社会环境的改变,其发病率也呈快速增长趋势。尽管血管再灌注治疗能挽救缺血顿抑心肌,但是无法使梗死的心肌细胞再生,因为成人心肌细胞大多数是终末分化,丧失细胞分裂能力,一旦损伤,其再生能力很小,只能由瘢痕组织代替。如何使坏死心肌或无功能心肌再生,再现其舒缩功能,一直是亟待科学家们攀登的高峰。干细胞移植技术的出现与成熟,为病损心脏的细胞重建和衰竭心脏的功能恢复提供了全新的治疗策略,给治疗这类疾病带来了新的曙光。
心脏的干细胞移植治疗,即直接用分离出来的干细胞或用经体外纯化、培养和增殖后的干细胞,移植到缺血坏死区域,试图通过新生的肌肉细胞替代纤维组织,从而改善心肌收缩和舒张功能。2001年,纽约医学院的Orlic等首次报道将骨髓干细胞移植到梗死小鼠心脏中,实验结果提示局部释放的骨髓细胞能重新产生心肌细胞,改善冠状动脉疾病的预后。同年,日本的Hamano研究小组和德国的Strauer等首先报道移植干细胞成分含量极少的骨髓单个核细胞,就可提高心肌梗死患者心脏功能。从此以后,对这一治疗措施的探索已经成为当前世界心血管病学研究的焦点之一,各种类型的干细胞和不同的移植途径被用来尝试再生梗死心肌的基础和临床研究。
第一节干细胞种类
干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞,在条件适宜或诱导下能够复制及分化成特殊种类细胞。目前,用于尝试治疗心肌缺血的干细胞大致分为两大类:其一,肌肉类细胞,主要指胚胎心肌或胚胎干细胞和骨骼肌干细胞;其次,非肌肉类细胞,主要为骨髓干细胞和外周血干细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同,干细胞又可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞主要包括胚胎心肌或胚胎干细胞。骨骼肌干细胞、骨髓干细胞和外周血干细胞则属于成体干细胞。
一、胚胎干细胞
胚胎干细胞是原始干细胞,来自早期胚胎(4～5天)的胚泡内细胞群,是一种高度
未分化细胞,具有全能分化性,能够被诱导分化为三个胚层的各种细胞。胚胎干细胞可在体外生长,并能在原始未分化状态无限繁殖,仍具有多能性,核型保持正常。有研究表明,将胚胎干细胞移植到梗死心肌后,7～32周可以形成稳定的心肌结构,明显改善血流动力学,促使梗死区域新生血管形成。但是,胚胎干细胞的研究应用于临床还存在很多技术上的难题需要解决。首先,胚胎干细胞移植存在供体来源受限、免疫排斥反应和移植带来的伦理、社会、法律等问题;其次,胚胎来源的心肌细胞移植到正常心肌后,会加重缺
血区域细胞死亡;第三,其安全性和有效性仍需进一步观察。新近研究发现,全能胚胎干
细胞经过体外培养后,至少可分化为具有3种动作电位的细胞。这些细胞具有自律性高、
峰电位低、动作电位时间延迟和易触发心律失常等特征。因此,胚胎干细胞用于临床治疗
还有很长的路要走。随着核移植(nuclear transfer)技术的进步,采用自身细胞核获取组
织相容性胚胎干细胞用于移植可能成为胚胎干细胞治疗的一个有效方法。
二、成体干细胞
成体干细胞是未分化的细胞出现在已分化的特定组织中,能够自我更新产生其来源的
所有特定细胞。与胚胎干细胞相比,成体干细胞移植不涉及伦理、法律、政治等社会问
题,它属于自身组织,没有免疫原性而且易于获得,因此成为近几年干细胞移植实验和临
床研究的主要细胞来源。然而,成体干细胞尚存在移植细胞没有出现再生、供体样品中有
其他少量干细胞的掺人、移植后细胞融合等诸多问题。
(一)骨骼肌干细胞
骨骼肌干细胞包括成肌细胞和卫星细胞,前者移植到损伤心肌组织中可以生存、增
殖,但不能与心肌组织紧密联系并同步收缩。动物实验发现,成肌细胞虽然在受损心脏内
能形成新的肌肉组织(肌管),转变为耐疲劳的慢收缩肌纤维,但是不能表达连接蛋白43
(gap junction protein connexin 43)和钙粘连素。这两种蛋白质是心肌细胞之间的缝隙连
接蛋白,缺乏这些蛋白,心肌细胞之间就不能实现电一机械耦联。卫星细胞移植到梗死心
肌组织中能够形成心肌纤维,促进损伤心肌修复和移植细胞的生长。其优点是容易获取、
体外易于培养、诱导方法成熟。有研究表明,骨骼肌细胞移植后可以明显改善心室功能,
可能与移植的细胞对心脏的几何形态产生有益的影响,延缓了心肌重构有关。但是,骨骼
肌干细胞数量有限,而且,骨骼肌细胞来源的细胞不易与周围心肌细胞形成连接,不能很
好地同步收缩,从而影响了移植效果并有可能诱发心律失常。
(二)骨髓干细胞
与骨骼肌成肌细胞相比,骨髓于细胞的应用显示了其特有的优势。首先,某些骨髓干
细胞为多潜能细胞,具有分化成为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞的潜能;其次,
由移植的骨髓干细胞分化来的心肌细胞能与周围受体肌肉细胞进行有效的电一机械耦联,
这恰能弥补骨骼肌干细胞移植的缺点。骨髓干细胞的组成很复杂,包括造血干细胞
(hematopoietic stem cells,HSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、
内皮祖细胞(endothelial stem/progenitor cells,EPCs)、多潜能成体祖细胞(multipotent
adult progenitor cells,MAPCs)以及其他功能不明的干细胞。除外这五种成分外,由于
分离和纯化方法不同,从骨髓液中又可分离得到骨髓单个核细胞群(bone marrow mono—
nuclear cells,BM—MNCs)、ACl33+细胞、边缘细胞群(side population cell,SP细胞)、
Lin—c-kit+细胞和各种单克隆干细胞等。临床常用的骨髓干细胞有BM-MNCs、MSCs、
ACl33十细胞和EPCs等。
1.骨髓单个核细胞群 BM-MNCs系将骨髓全血利用淋巴细胞分离液经过梯度密度
离心法得到的多个单个核细胞混合。BM-MNCs汇集了所有的骨髓于细胞成分,含有诸如
间充质干细胞、造血干细胞和内皮祖细胞之类的干细胞,具有容易从自体采集、操作简单
和不存在免疫排斥反应等优势。
骨髓单个核混合细胞移植虽然简单易行,但是其细胞成分复杂,干细胞含量极低,向
心肌细胞和血管内皮细胞分化的发生概率很低(约为万分之一),其修复梗死心脏作用很
有限。目前,人们正在试图从骨髓中分离出干细胞成分较高的单个细胞群作为供体细胞,
旨在提高移植临床疗效。
2•骨髓间充质细胞MSCs在骨髓中含量极少,(o.1～1)×10s个骨髓细胞中含有】
个MSCs。MSCs具有自我更新和分化的潜能,为中胚层发育的早期细胞,可分化为骨、
软骨、脂肪、心肌细胞、神经细胞及神经胶原细胞等。MSCs的鉴定和纯化多利用流式细
胞技术或免疫磁珠的方法,通过测定MSCs表面标志进行,但由于MSCs分离和培养方法
不同,其表面标志存在很大差异,常用的阳性表面标志为CD44+、CD71+、SH+、SH+
等,阴性表面标志为CD34一、CD45一和CDl4一等。Makino等从大鼠骨髓基质细胞中分离
到成心肌细胞系,在体外经5一氮胞苷作用,观察到细胞的自主搏动,具有窦房结电位,
电镜下显示心肌超微结构。Silva等使用特殊慢性缺血装置处理12只狗的冠状动脉血管,
研究MSCS移植在慢性心肌缺血中的效果,6只狗经心内膜下注射10ml MSCs(1×10Vml),
另外6只注射lOml缓冲液。结果显示,移植30天后治疗组静息状态下左室射血分数
(1eft ventricular ejection fraction,LVEF)增加,MSCs分化为内皮细胞、血管平滑肌细胞促进血管生成并改善了心脏功能。但是,MSCs的移植必须经过培养,这样会增加一些
生物因素,可能会给人体带来某些不NN素,因此,较少应用于临床。
3•内皮祖细胞内皮祖细胞可以在病理或生理条件下,通过某些因素刺激(如缺血
损伤)动员到外周血中,形成新生血管。将体外培养并标记的人内皮祖细胞经静脉注入大
鼠心肌梗死模型体内,可以看到移植的内皮祖细胞聚集在心肌缺血区,参与心肌组织内新
生血管的形成,局部心室室壁运动和毛细血管密度均显著优于对照组。
4•ACl33+细胞群ACl33+系干细胞/前体细胞表面标记蛋白,表达血管内皮细胞受
怀3(vascular endothelial growth{actor receptor-3,VEGFR-3)。人类ACl33+细胞主要
为CD34+细胞群,具有内皮干细胞和祖细胞表型和功能特征,主要在血管新生方面起作
用。
5•造血干细胞HSCs能够分化为所有血液细胞,来源于骨髓、外周血及脐带血等。
2001年Jackson小组研究显示HSCs在特定条件下可以分化为心肌细胞。但另有研究显
示,移植HSCs不能实现再生心肌与血管效应,HSCs在体内并没有转化为心肌细胞,而
仍然具有HSCs的表型。此外,由于在体外培养HSCs很困难,而移植的效果又与HSCs
的数量有关,因此限制了其在缺血性心脏病中的应用。其后,许多科学家进行了相关的动
物实验和临床研究,目前尚未有一致的结果。
6•某些细胞因子除用骨髓干细胞作移植对象外,科学家们又开始尝试用某些能促
进干细胞分化的细胞因子来刺激自身骨髓干细胞分化。骨髓干细胞分化为心肌细胞和血管
内皮细胞,由两个5廷ilN素决定,损伤的组织环境和足够数量的多能干细胞。基于这一
点,Orlic等尝试了在小鼠冠状动脉结扎后静脉注射干细胞因子(SCF)和粒细胞集落刺
激因子(G-CSF),发现小鼠骨髓中的干细胞能归巢到梗死区域,并发生了复制和分化。
与移植骨髓干细胞相比,注射干细胞因子具有无创伤性,死亡率低的优点。
(三)外J司血干细胞
外周血干细胞通常指造血干细胞,同骨髓干细胞移植相比,外周血干细胞移植具有采
集方便等优点,供者不需要麻醉,无多部位骨髓穿刺抽骨髓的痛苦和不便,患者易于接
受。目前研究者们尝试用SCF或G-CSF等细胞因子动员自身骨髓干细胞向外周血释放,
然后收集并移植外周血单个核细胞到动物梗死心肌中,观察结果显示其改善心功能程度并
不如移植骨髓单个核细胞那样令人满意,而且所移植的血细胞并不能整合成新生毛细血
管。
第二节 干细胞移植治疗的可能机制
目前机制尚不十分清楚。通常认为干细胞移植可以增加细胞因子如血管内皮生长因子
(vascular endothelial growth factor,VEGF)的释放,促进缺血区域新生血管的形成,改
善灌注,改善冬眠心肌和顿抑心肌功能,减少心室扩张及心室重构。移植的干细胞具有可
塑性,然而这种观点受到了挑战。移植的可能机制包括以下几种。
一、坏死心肌的修复与再生
2001年Orlic等首次在Nature上报道了骨髓干细胞可以分化再生为心肌细胞。他们
将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)转基因雄性小鼠的
骨髓Lin—c—kit+细胞局部注射到雌性小鼠的梗死心肌边缘区,术后第9天发现在梗死边缘区68%为新生的心肌细胞,且细胞移植组LVEF、左室舒张末期容积等心功能指标显著
改善。另有一些研究也获得了类似证据。但2004年两个独立的小组采用高技术水平的遗
传手段监测移植的骨髓干细胞不能分化为心肌细胞,只是分化为不同的血液细胞。同时有
人认为干细胞“横向分化”只不过是细胞间的融合,并且细胞融合可以通过抗凋亡及促进
缺血损伤心肌存活来改善心脏功能。然而,Kajstura等又以Y染色体标记和测定DNA含
量/核比值的方法证明了骨髓干细胞在心肌梗死局部分化为心肌细胞和冠状动脉血管,而
未分化为造血组织,也未发生细胞融合。
二、再生血管改善灌注
Tse等应用电一机械标记(electromechanical mapping system,NOGA)系统将自体骨
髓干细胞移植到8例严重缺血性心力衰竭患者心肌内,3个月随访磁共振扫描(magnetic
resonance imaging,MRI)显示伴随缺血室壁灌注的改善,心功能明显改善。Kocher等
给急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)大鼠移植CD34+细胞,于移植后2
周行组织学检查,发现在梗死部存在较多带有荧光标记的微血管、毛细血管生长,细胞移
植组血管数目增加,同时LVEF改善。
三、血管活性物质的效应
Makino等在5一氮胞苷处理过的MSCs体外培养中发现,分化的MSCs表达特异的心
房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)基因,并可见心房颗粒。ANP是体内强大的
利钠、利尿、舒张血管、抗肾素一血管紧张素一醛固酮效应的血管活性物质,其增多必然产
生心功能改善效应。这至少可部分解释在细胞移植早期,细胞尚未分化或融合,血管尚未
充分再生改善心肌灌注时,移植的MSCs在内环境网络信号调控下,通过自分泌、旁分泌
产生和释放大量血管活性物质作用于心脏,扩张血管,改善心功能的机制。
第三节 干细胞的临床应用
自2001年首次进行干细胞移植临床试验至今,已经进行了多项临床试验。这些试验
分别采用骨髓来源千细胞、骨骼肌成纤维细胞、HSCs等多种细胞类型。
一、骨骼肌干细胞
2001年巴黎比夏医院的Menasche等首先将成肌细胞移植应用于临床,发现移植骨骼
肌成纤维细胞能改善梗死后心力衰竭。2003年又对10例心肌梗死伴严重心力衰竭患者,
在冠状动脉搭桥术同时进行骨骼肌成肌细胞移植,随访10个半月,临床心功能提高,心
肌收缩功能改善,1例患者死于与移植无关的并发症,但4例发生了室性心动过速,都需
要安装自动心脏复律除颤器(automatic implantable cardioverter defibrillator,AICD)。
同年,Pagani等对4例行骨骼肌成肌细胞移植的患者活检,也发现移植的骨骼肌细胞虽
然能分化为成熟肌管,但表达骨骼肌特异性蛋白——肌球蛋白重链,与邻近宿主心肌细胞
之间缺乏电一机械耦联。2004年,Siminiak等对10例心肌梗死病人在冠状动脉搭桥同时移
植骨骼肌干细胞,有2例于手术早期发生持续性室性心动过速,另2例于随访2周出现持
续性室性心动过速,其他患者需预防性应用胺碘酮以防止持续性室性心动过速发作。动物
实验发现,这些成肌细胞虽然在受损心脏内能形成新的肌肉组织(肌管),转变为耐疲劳
的慢收缩肌纤维,但是不能表达连接蛋白43和钙粘连素,缺乏这些蛋白,心肌细胞之间
就不能实现电一机械耦联。由此可见,其致心律失常危险仍是阻止其临床应用的主要因素。
但是,2005年Dib等的38例非随机、多中心的临床荟萃资料显示,骨骼成肌细胞移
植治疗缺血性心肌病患者,并不引起严重心律失常发生。Abraham等发现通过遗传修饰
促使成肌细胞表达连接蛋白43可减少移植后心律失常的发生。Menasche等的研究中,4
例心律失常分别发生在术后的第11天、12天、13天、22天,而在之后数月的随访中未
有发生,因此Menasche认为心律失常可能是成肌细胞移植的“潜在但是暂时”的不良反
应。由于目前的临床实验规模小,缺乏对照组,并不能区分这些心律失常是由移植的成肌
细胞引起还是这些病人心脏本身病灶引起,因为这些病人原来就是易发生心律失常的高危
人群。自体成肌细胞移植还需在更多病人进行更长期的随访对照研究,才能彻底评估其安
全性。正在进行的MAGIC(Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy)
随机对照临床试验将对自体成肌细胞移植在接受CABG和除颤器植入的慢性心力衰竭患
者中的疗效和安全性进行评价。